1. Introducción

Durante milenios, la humanidad ha valorado las setas como un importante recurso comestible y médico. Actualmente, las sustancias derivadas de las setas con propiedades inmunomoduladoras y antitumorales se usan como complementos dietéticos o medicamentos.

La mayoría de las setas cultivadas tales como Ganoderma lucidum, Lentinus edodes (Shiitake), Schizophyllum sp. y muchos otras se recolectaron y utilizaron durante siglos en Corea, China, Japón y Rusia oriental (Wasser, 2002). La materia seca de cuerpos fructíferos de los hongos es aproximadamente del 5-15%, poseen un contenido muy bajo en grasas y un 19-35% de proteínas. Los cuerpos fructíferos de los hongos son ricos en vitaminas, principalmente B1, B2, C y D2 (Manzi, Gambelli, Marconi, Vivanti, y Pizzoferrato,1999; Mattila, Suonpää, y Piironen, 2000). El contenido de carbohidratos, presentes principalmente como polisacáridos o glicoproteínas, oscila entre el 50-90%. Los polisacáridos de setas más abundantes son la quitina, hemicelulosas, β y α-glucanos, mananos, xilanos y galactanos. El Mw de masa molecular medio de estos varía de acuerdo a la fuente y oscila entre 5 y 2000 kDa (Bohn y Bemiller, 1995). Los polisacáridos de setas están presentes principalmente como glucanos lineales y ramificados con diferentes tipos de enlaces glicosídicos, tales como (1→ 3), (1→ 6) -β-glucanos y (1→3) α-glucanos, pero son algunos heteroglicanos verdaderos los que contienen ácido glucurónico, xilosa, galactosa, manosa, arabinosa o ribosa (Wasser, 2002). Al igual que los polisacáridos originados a partir de otros productos alimenticios, estos contribuyen al proceso digestivo como las fibras dietéticas solubles o insolubles dependiendo de su estructura molecular y conformación (Cheung y Lee, 1998; Johansson et al, 2006;. Manzi, Marconi, Aguzzi, y Pizzoferrato, 2004; Manzi y Pizzoferrato, 2000; Prosky, Asp, Schweizer, DeVreis, y Furda, 1988).

Los polisacáridos de seta con acción antitumoral difieren notablemente en su composición química y configuración, así como en sus propiedades físicas. La actividad antitumoral destaca por un amplio rango de glucanos que se extienden desde los homopolímeros hasta los heteropolímeros altamente complejos (Ooi y Lui, 1999). Las diferencias en su actividad pueden ser correlacionadas con la solubilidad en agua, el tamaño de las moléculas, la tasa de ramificación y la forma (Wasser, 2002). La conformación terciaria de triple hélice de los β-(1→3)-glucanos de hongos medicinales destaca por su actividad inmunoestimulante (Maeda, Watanabe, Chihara, y Rokutanda, 1988). Además de los conocidos β-(1→3)-glucanos antitumorales, se ha descrito un gran rango de glucanos biológicamente activos de otra estructura. Existen cadenas de polisacáridos lineales o ramificados con una cadena principal compuesta de unidades de glucosa de enlaces α y/o β y diferentes cadenas laterales que pueden unirse de distintas maneras. La principal fuente de polisacáridos biológicamente activos parecen ser las paredes celulares de hongos que consisten principalmente en complejos glucano-quitina. Sin embargo, la quitina fúngica no posee actividad antitumoral (Mizuno, Sakai, y Chigara, 1995).

 La importancia comercial de los polisacáridos de hongos destacó en el campo de los alimentos funcionales. Parcialmente, las setas cultivas del género Pleurotus son interesantes debido a los β-glucanos los cuales demuestran una gran inmunomodulación, además de propiedades antioxidantes, antiinflamatorias y analgésicas (Bobek y Galbavy, 2001; Smiderle et al, 2008).. Las setas del género Pleurotus se cultivan en varios países debido a su gran capacidad de adaptación. La producción anual de estos hongos es de más de 900.000 toneladas. Existe una gran cantidad de diferentes especies del género Pleurotus que poseen propiedades farmacológicas, por ejemplo P. florida, P. tuber-regium, P. pulmonarius, P. ostreatus y P. eryngii (Ragunathan, Gurusamy, Palaniswamy, y Swaminathan, 1996). Los propios glucanos biológicamente activos o sus complejos con proteínas, así como otros polisacáridos aislados de cuerpos fructíferos de estas especies son de interés para la preparación de los nuevos complementos alimenticios. La solubilidad en agua es un factor importante en la mejora de algunas actividades biológicas de los glucanos de los hongos. Puede ser fácil lograrla mediante la introducción de grupos cargados. El derivado carboximetilado de pleurano, un β-glucano alcalino insoluble aislado de Pleurotus sp. (Karácsonyi y Kuniak, 1994), presentó efectos inmunomoduladores que incluyen la estimulación de la actividad fagocítica (Paulik et al., 1996). Los β-glucanos aislados altamente ramificados de los esclerocios de Pleurotus tuber-regium y sus derivados sulfatados mostraron potentes actividades antitumorales in vivo e in vitro (Tao, Zhang, y Cheung, 2006), este último mostró una actividad antitumoral in vitro relativamente mayor contra la línea de células humanas de cáncer hepático HepG2 que el polisacárido nativo. Otro β-glucano sulfatado de esta fuente mostró una actividad antiviral fuerte contra el virus del herpes simple, mientras que el correspondiente polisacárido nativo estaba inactivo (Zhang, Cheung, Ooi, y Zhang, 2004). Un α-glucano de bajo peso molecular aislado del micelio de la seta P. ostreatus cultivada en líquido inhibió la proliferación de cáncer de colon celular a través de la inducción de la apoptosis (Lavi, Friesem, Geresh, Hadar, y Schwartz, 2006). El (1→6)-glucano soluble en agua obtenido de cuerpos fructíferos de P. florida mostraron una activación significativa de los macrófagos a través de la liberación de óxido nítrico (Rout, Mondal, Chakraborty, Pramanik, y el Islam, 2005, 2004).

 Los polisacáridos de hongos, así como productos de hidrólisis parcial, poseen una función prebiótica potencial como los demás. El término prebiótico fue introducido por Gibson y Roberfroid (1995) quienes intercambiaron «pro» por «pre», lo que significa «antes» o «para». Estos definieron los prebióticos como «un ingrediente alimenticio no digestivo que estimula selectivamente el crecimiento y/o actividad de una o de un número limitado de bacterias en el colon». Esta definición se solapa parcialmente con la de la fibra dietética con la excepción de la digestibilidad por parte de ciertas cepas probióticas (Gibson, Beatty, Wang, y Cummings, 1995; Gibson y Roberfroid, 1995; Hidaka, Eida, y Takizawa Teta, 1986; Schrezenmeir y DeVrese, 2001; Su, Henriksson y Mitchell, 2007). Se ha demostrado la selectividad de los prebióticos para las bifidobacterias, que pueden ser promovidas por la ingesta de sustancias tales como fructooligosacáridos e inulina (Gibson y Roberfroid, 1995; Gibson et al, 1995.; Hidaka et al., 1986), oligosacáridos transgalactosilados (Tanaka, Takayama, y Morotomi, 1983;. Ito et al, 1993; Rowland y Tanaka, 1993) y oligosacáridos de soja (Hayakawa et al, 1990;. Saito, Tanaka, y Rowland, 1992). Los polisacáridos, principalmente cereales β-glucanos (Su et al., 2007), y especialmente fragmentos oligoméricos, (Grootaert et al., 2007; Kontula et al., 1998; Lee Park, Jung, y Shin, 2002; Manderson et al., 2005; Olano-Martin, Ginson, y Rastall, 2002) son también usados como prebióticos. Se ha constatado que los β-glucanos hidrolizados de avena estimulan el crecimiento de tres cepas de Bifidobacterium y Lactobacillus rhamosus GG (Kontula et al., 1998). Grootaert et al. (2007) revisaron la potencia prebiótica de oligosacáridos arabinoxilanos. Se ha demostrado que los oligosacáridos de quitosana poseen un efecto prebiótico en el Bifidobacterium Bifidum y el Lactobacillus sp. (Lee et al., 2002). Olano-Martin et al. (2002) demostraron el carácter prebiótico de pectinas y oligosacáridos pécticos. El objetivo de este estudio era (a) el aislamiento y la caracterización de los glucanos de cuerpos fructíferos de las setas P. ostreatus (cuatro cepas) y P. eryngii cultivadas en la República Checa y (b) las pruebas de extractos acuosos y alcalinos de estas fuentes para su potencial prebiótico en relación con las cepas probióticas seleccionadas.

 2. Experimental

2.1. Muestras de cuerpos fructíferos

Las setas P. ostreatus (cepas 70, 77, L22, 137) y P. eryngii (cepas no especificadas) se cultivaron en condiciones controladas por el productor de hongos Rudolf Ryzner en la región de Moravia del Sur, República Checa. Se separaron los tallos del sombrero y se homogeneizaron con el dispensador de laboratorio DI 25 básico equipado con el elemento de dispersión S25 N-25 G (IKA-Werke GmbH, Alemania). Las muestras homogeneizadas se mantuvieron a -20º C.

 2.2. Aislamiento y purificación de polisacáridos

Las fracciones de polisacáridos acuosos y alcalinos solubles e insolubles se aislaron de los tallos de las dos especies de Pleurotus según el método modificado de Freimund (Freimund, Sauter, Käppeli, y Dutler, 2003) como se muestra en la Fig. 1. Los homogeneizados se lavaron con un 80% (w/w) de etanol, luego con agua destilada y se extrajeron con agua hirviendo durante 6 horas. Los extractos se incubaron con α-amilasa de Bacillus sp. (1:500 v / v) con pH7 durante 30 min para eliminar los α-glucanos. Para llevar a cabo la desproteinización se aplicó el reactivo Sevag (cloroformo/butanol 4:1, v/v). Luego, los sobrenadantes desproteinizados se dializaron y liofilizaron para generar fracciones acuosas (L1). Las partes insolubles se extrajeron con solución de hidróxido de sodio 1M que contiene 0,05% de sodio borohidruro. Se indicaron las partes sólidas como la fracción insoluble (S). El sobrenadante se ajustó de la misma manera que el anterior sobrenadante para producir la fracción alcalina (L2).

Los extractos acuosos y alcalinos originados a partir de las cepas ricas en glucanos 70 y 77 se trataron adicionalmente con el reactivo fenólico para eliminar las proteínas recordatorio (reminder proteins) (Westphal y Jann, 1965). Las fracciones purificadas se asignaron de acuerdo a las capas separadas como L1a y L2a (fase fenólica) y L1b y L2b (fase acuosa).

 2.3. Métodos de análisis

A todos los productos de aislamiento se les analizó el contenido de carbono, hidrógeno y nitrógeno mediante el Elementar vario EL III (Elementar Analysensysteme GmbH, Alemania). La cromatografía de permeación en gel de alto rendimiento (HP-GPC) de los extractos se llevó a cabo a temperatura ambiente usando la precolumna PL Aquagel-OH, seguido por la columna mixta PL Aquagel-OH (Polymer Laboratories Ltd., UK), bomba de alta presión LCP 4100 (ECOM, República Checa) y un detector de índice de refracción Shodex RI 71 (Dionex SOFTRON GmbH, Alemania). Las muestras se eluyeron a un caudal de 0,5 ml min-1 con solución salina (0,05 M NaH2PO4, Na2HPO4 0,05 M, 0,2 M NaNO3 y 0,02% de NaN3) como fase móvil.

(Ver fig.1. en documento adjunto) Esquema de aislamiento y purificación de fracciones de polisacáridos de cepas de Pleurotus ostreatus y Pleurotus eryngii.

 Los azúcares neutros se liberaron por medio de la hidrólisis de Saeman (Selvendran, Marzo, y Ring, 1979) y se analizaron como acetatos de alditol mediante GC utilizando un cromatógrafo GC 07 (Labio, República Checa). Se utilizó una columna capilar DB.1 Agilent (J y W) de 30 mm 0.25 mm d.i. y una película de 0.1 mn de espesor. Las temperaturas del inyector y del detector fueron, respectivamente, 220 y 230ºC. El programa de temperatura del horno fue el siguiente: 120ºC durante 1 min, y luego aumentó a 130ºC (2,5ºC/min) durante 30 min, y finalmente se elevó a 220ºC (5ºC/min).

 El espectro FT-IR (región espectral 4000-400 cm-1, resolución 2 cm^-1) de las muestras sólidas en forma de comprimidos KBr se registraron en el espectrofotómetro FT-IR 1760 X (Perkin Elmer, EE.UU.). Los espectros FT-Raman de las muestras en polvo se registraron mediante el uso del espectómetro Bruker FT-Raman (FRA 106/S, Equinox 55/S) equipado con un divisor de haz de cuarzo, un detector de germanio de nitrógeno líquido refrigerado y una alteración de 1064 nm de un láser de Nd: YAG. El poder del láser se fijó en 100 mW, y se acumularon 256 exploraciones con una resolución espectral de 2,0 cm^-1. Los espectros de vibración fueron de 10 puntos de filtrada. Posteriormente, se corrigió el punto de referencia usando el software Origin 6.0 (Microcal Origin). Los segundos derivados de los espectros se utilizaron para la determinación del número de onda de las bandas solapadas. Los espectros de alta resolución ¹³C CP / MAS (polarización cruzada / ángulo mágico hilado) RMN se midieron mediante el uso del espectrómetro Bruker Avance 500 en rotores ZrO2de 4 mm con frecuencia de 125,8 MHz. La frecuencia del hilado fue de 10-11 kHz, el tiempo de contacto de 2 ms, la repetición de retardo 3 s, el ancho espectral de 37,5 kHz y el número de exploraciones fueron 2100-5400. Se calibraron ¹³C desplazamientos químicos con glicina estándar (un campo bajo de la señal del carbonilo en 176,0 ppm desde TMS) por sustitución de muestra. Se metilaron pequeñas cantidades de fracciones (~8 mg) de acuerdo con Ciucanu y Caprita (2007) para proporcionar un producto que presente la no absorción IR de hidroxilo. Se hidrolizaron las muestras metiladas con 2 mol 1^-1 de ácido fórmico (1 ml) durante l h a 100ºC. Los productos obtenidos se redujeron con 1 mol 1^-1 de borohidruro de sodio, a continuación, se convirtieron en sus acetatos de alditol y se analizaron por el sistema GLC-MS (5890 Series II, 5972 detector selectivo de masas de serie, HP-5: 5% de fenilo, 95% de dimetilpolisiloxano). Los datos obtenidos se asignaron utilizando el rango NITO2.L.

El contenido del total y α-1,4-glucanos se determinaron en las fracciones obtenidas de acuerdo con el procedimiento de ensayo Pr K-YBGL 10/2005 de β-glucano de la Seta y la Levadura (Megazyme, Irlanda). La estimación de glucanos sin almidón se basa en la diferencia entre el contenido de glucosa tras la hidrólisis ácida total de glucanos y la hidrólisis enzimática específica de α-1,4-glucanos. Las muestras se secaron previamente bajo una corriente de nitrógeno para asegurar la correcta concentración de ácido importante para la hidrólisis. Los valores de contenido de glucanos se calcularon en materia seca.

 2.4. Actividad prebiótica

 La actividad prebiótica potencial se probó en los extractos acuosos (L1) y alcalinos (L2) de P. ostreatus de la cepa 77 y P. eryngii. Las cepas seleccionadas para las pruebas eran de Lactobacillus sp. (4 cepas: Lac A-D), Bifidobacterium sp. (3 cepas: Bifi A-C) y Enterococcus faecium (2 cepas: ENT A y B). Estas cepas se escogieron de la colección del laboratorio de cepas probióticas. Los ensayos de cultivo se realizaron a una media de 37°C basados en MRS (Oxoide) utilizado comúnmente para el cultivo de bacterias de ácido láctico. El medio se preparó sin glucosa y se mezcló con diferentes porciones de extracto líquido y agua (la premezcla final contiene un 50% de medio MRS). El medio se suministra con un  0,05% de cisteína. La característica de crecimiento se comparó con el medio mezclado solo con agua. La tasa máxima de crecimiento, la concentración máxima de biomasa y la producción de ácido final (como disminución de pH) se observaron en cuatro cultivos independientes.

 3. Resultados y discusión

3.1. Aislamiento y purificación de polisacáridos

Se elaboraron los procedimientos adecuados para el aislamiento de polisacáridos de cuerpos fructíferos (tallos) resumidos en la Fig. 1. Las muestras homogeneizadas se lavaron posteriormente con un 80% de etanol y agua fría para eliminar las moléculas pequeñas, incluyendo mono y oligosacáridos. Luego, se extrajeron los polisacáridos con agua hirviendo y se aislaron por filtración los sobrenadantes. Sin embargo, los análisis de los residuos sólidos confirman que las fracciones insolubles en agua todavía contenían una alta cantidad de glucanos que se pueden aislar. Es por eso que se incluyó una etapa de la extracción alcalina en el procedimiento de aislamiento. El almidón se fragmentó por α-amilasa para liberar maltosa, que se eliminó por diálisis. Multiplicando la aplicación del reactivo Sevag se condujo a la eliminación parcial de proteínas, mientras que se logró la desproteinización más completa mediante el tratamiento de los extractos y/o liofilizados disueltos con reactivo fenólico. Así, se obtuvieron tres fracciones: soluble en agua (L1), soluble en álcali (L2) e insolubles (S).

 3.2. Contenido de glucanos en las fracciones obtenidas

La Tabla 1 describe la composición de las fracciones aisladas L1, L2 y S. Estos productos contenían 86.7-91.5% de materia seca y mostraron un gran rango de contenidos de glucanos sin almidón (44,2 hasta 90,1% para P. ostreatus y 33.6-66,4% para P. eryngii). En todos los casos las fracciones L1 contenían menos NSG que las correspondientes fracciones L2 y S. El nivel de NSG en las fracciones variaron significativamente en las cepas de P. ostreatus. En la fracción de L2 de la cepa L22 se observó la cantidad más alta de estos polisacáridos (90,1%); los más bajos se percibieron en la cepa 137 (44.2 a 65.8%) y P. eryngii (33,6 a 66,4%). El contenido de almidón fue muy bajo para L1 y L2 debido al tratamiento α-amilasa, mientras que algunas fracciones S contenían cantidades notables de almidón (1,2-2,6%).

(Ver Tabla 1)

3.3. Composición de carbohidratos y enlaces

La composición de carbohidratos de las fracciones obtenidas por GC se resume en la Tabla 1. La D-glucosa es el azúcar principal en todos los casos, aunque también se encontraron pequeñas cantidades de D-galactosa y D-manosa, de modo que los galactomananos están presentes en algunas fracciones como un componente menor. Se observó D-glucosamina solo en las fracciones S indicando quitina en complejo con glucanos. El contenido de D-glucosa obtenido por GC estaba bien correlacionado con la determinación enzimática del total de glucanos (Fig. 2), por lo que estos polisacáridos son la principal fuente de D-glucosa en las fracciones. El análisis de metilación de las fracciones L1 reveló la presencia de 2,3,4,6-tetra-, 2,4,6-tri-, 2,3,4-tri-y 2,4-di-O-metil-glucosa (proporciones molares 1:4:3:1), mientras que las fracciones S contenían mucho menos 2,3,4-tri-O-metil-glucosa (proporciones molares 1:4:0.2:0.8) (Tabla 2). Estos resultados confirman que L1 y S son 1,3-1,6-glucanos altamente ramificados. En cambio, las fracciones L2 sólo contenían 2,4,6-tri-O-metil-glucosa, por lo que estos son 1,3-glucanos lineales.

3.4. Extracción de las proteínas

La cantidad de nitrógeno (% m/m) en las fracciones aisladas obtenidas mediante análisis elementales se representan en la Tabla 3. Este valor variaba para las diferentes especies y cepas. Por lo general, las muestras ricas en glucanos (>85%) no contenían nitrógeno o mostraron sólo pequeñas cantidades de este elemento (hasta 1%). Basándonos en el análisis de azúcar afirmamos que el nitrógeno se originó a partir de proteínas en las fracciones L1 y L2 (no D-glucosamina) y de quitina en las fracciones S (1.8 a 3.7% de D-glucosamina). Las cantidades significativas de nitrógeno (1,80-2,71% para P. ostreatus y 6,26% para P. eryngii) se observaron en las fracciones L1 incluso tras el tratamiento con reactivo Sevag. Así, estas fracciones se contaminaron con proteínas extraídas de cuerpos fructíferos por primera vez en la etapa de extracción acuosa. Estas proteínas están probablemente ligadas a glucanos solubles, y el método Sevag no fue capaz de separar completamente estos compuestos. Por otra parte, las fracciones L2 mostraron contenidos de nitrógeno mucho más bajos (0,81-1,76% para P. ostreatus y 2,06% para P. eryngii). Además, la notable disminución de contenido de proteína establecida como una cantidad de nitrógeno fue evidente para los extractos purificados con reactivo fenólico: las fracciones L2b originadas a partir de las cepas 70 y 77 no contenían nitrógeno. De este modo, el tratamiento con fenol condujo a completar la eliminación de proteínas solo a partir de las fracciones L2. Por lo tanto, los glucanos alcalinos solubles no se unen fuertemente a las proteínas como glucanos solubles en agua.

 3.5. Cromatografía de permeación en gel

En la Fig. 3 se muestran los cromatogramas de GPC de los extractos acuosos y alcalinos típicos obtenidos a partir de tallos de Pleurotus sp.. El peso molecular de la fracción principal de glucano estaba en el rango 2900-2200 kDa, mientras que se detectaron también moléculas más pequeñas (110-10,5 kDa). Estas fracciones de bajo peso molecular son probablemente proteínas y/o moléculas de polisacáridos parcialmente degradadas. El extracto acuoso obtenido a partir de tallos de la cepa 77 de P. ostreatus tenía dos picos que indican las fracciones de los pesos moleculares altos y bajos de 2200 y 10,5 kDa, respectivamente. El extracto alcalino correspondiente contenía polisacáridos de pesos moleculares significativamente más altos, 2900 y 110,3 kDa. Las fracciones moleculares altas y bajas también se detectaron a través de extractos acuosos (2200 y 12 kDa) y alcalinos (2300 y 20,3 kDa)

3.6. Espectroscopía infrarroja y Raman

Los espectros FT-IR de todas las fracciones obtenidas a partir de tallos de la cepa 77 de P. ostreatus se muestran en la Fig. 4. Los espectros de las correspondientes fracciones aisladas a partir de tallos de otras especies/cepas del género Pleurotus eran similares a los presentados en esta figura. Los espectros de las fracciones L1, L2 y S mostraron varias bandas superpuestas IR muy intensas en 950-1200 cm^-1 (principalmente vibraciones de estiramiento CC y CO en anillos de tipo piranosa) que indica la presencia de polisacáridos como componente principal. Parcialmente, se le asignó la banda intensa entre 1150-1160 cm^-1 al estiramiento de los enlaces glucosídicos de COC. La banda más débil que estaba cerca de 894 cm^-1 y se encontró en los espectros de L1 y S es específica para los β-glucosídicos y, por lo tanto, indica la presencia de β-glucanos. Las otras bandas y hombros asignados a β-glucanos se encontraron cerca de 1376, 1317, 1162, 1100, 1080, 1040 y 990 cm^-1 (Gutiérrez, Prieto, y Martínez, 1996; Šandula, Kogan, Kacuráková, y Machová, 1999). En cambio, el espectro de L2 posee varias bandas en 1367, 930, 853, 822, 548 y 454 cm^-1 que indican un α-1,3-glucano (Chen, Zhou, Zhang, Nakamura, y Norisuye, 1998;? Unursaikhan, Xu, Zeng, y Zhang, 2006; Wang, Deng, Li, y Tan, 2007; Zhang, Zhang, y Chen, 1999; Šandula et al, 1999). Dos bandas entre 1650 y 1540 cm^-1 (L1 y L2) se asignaron, respectivamente, a las vibraciones de proteínas del amida I y del amida II (Belton et al., 1995). Las bandas del amida I se solaparon por deformación en el plano de agua cerca de 1640 cm^-1 y, por lo tanto, no pueden usarse para la identificación de enlaces amida. La banda del amida II de L2 es mucho menos pronunciada que la banda correspondiente de L1, por lo que la fracción anterior contenía significativamente más proteínas que esta última.

3.7. ¹³C CP / MAS RMN

En la Fig. 6 se muestran los espectros ¹³C CP/MAS RMN de las fracciones L1, L2 y S obtenidas a partir de los tallos de P. ostreatus de la cepa 77 y P. eryngii. Las características espectrales de L1 son bastante similares a las de S, mientras que L2 mostró una diferencia evidente en la posición de señales de carbono polisacárido. La configuración de β de los residuos D-Glc se indicó por medio de la resonancia C-1 entre 103,3-103,6 ppm; la ramificación en C-6 se confirmó por señales C-6 entre 68,9-69,1 ppm (0 unidades sustituidas) y entre 62,0-62,3 ppm (unidades no sustituidas) (Chenghua et al, 2000.; Saito, Yoshioka, Yokoi, y Yamada, 1990; Yoshioka, Tabeta, Saito, Uehara, y Fukcoka, 1985; Saito, Yokoi, y Yoshioka, 1989; Saito, Onki, y Sasaki, 1979; Stipanovic y Stevens, 1981). La gran multiplicación de la señal C-3 entre 86,6-85,4 ppm se podría atribuir a la presencia de residuos 1,3 enlazados (Chenghua et al., 2000). El pico más intenso entre 74,1-74,4 ppm corresponde a C-2, el hombro de cerca de 76,0 ppm a C-5; los otros carbonos sobre todo contribuyen entre 65-80 ppm. Las señales de resonancia en 173,5 ppm (C=O), 51,1 ppm (C-2) y 22,6-23,1 ppm (CH3) indican la presencia de quitina en fracciones de S (Focher et al, 1992;. Heux, Brugnerotto, Desbrières, Versali, y Rinaudo, 2000; Tanner, Chanzy, Vincendon, Roux, y Gaill, 1990). En cambio, la resonancia

C-1 en 100,9-101,0 ppm indica una configuración α de los residuos D-Glc en L2, y la señal ancha en 84,5-82,2 ppm es característico de enlaces α-1,3 (Unursaikhan et al, 2006;. Wang et al, 2007;. Zhang et al., 1999). El pico intenso y nítido cerca de 71,5 ppm y el menor en 60,5 ppm corresponde, respectivamente, a los carbonos C-2 y C-6 de α-1 ,3-glucano. Los espectros de L1 y L2, sin embargo, mostraron varios picos y hombros correspondientes, respectivamente, a α y β glucanos, por lo que la separación de estos polisacáridos mediante la extracción acuosa y alcalina no era completa. El pico intenso y ancho de carbonos carbonilos, así como varios picos en las regiones de carbonos aromáticos (120-160 ppm) y alifáticos (10-60 ppm) indicaron la presencia de proteínas en las fracciones L1, más pronunciadas en el caso de P. eryngii (Belton, Gil, Grant, Alberti, y Tatham, 1998; Belton et al., 1995).

3.8. Actividad prebiótica

La diferencia entre los valores de los parámetros analizados (tasa máxima de crecimiento, concentración máxima de biomasa y producción de ácido), medido por el medio sin y con el extracto, se compara para las cepas específicas y extractos (Fig. 7a-d). El valor positivo muestra un efecto estimulante del extracto relacionado con la característica del crecimiento dependiendo del extracto utilizado y la especificidad de la cepa. En la mayoría de los casos los extractos L1 y L2 de P. ostreatus y P. eryngii apoyan la tasa de crecimiento de la bacteria probiótica, biomasa y la producción de AGCC (ácidos grasos de cadena corta) para cepas de Lactobacillus. Los extractos de P. eryngii resultaron ser mejor fuente de crecimiento que los de P. ostreatus. La cepa de Lactobacillus Lac A creció a la misma velocidad que el control con extracto acuoso L1 de P. eryngii, pero el extracto alcalino L2 duplicó esta tasa. Las cepas Lac B, C, D utilizaron ambos extractos con resultados similares. Las cepas de Bifidobacterium mostraron diferencias notables. La cepa de Bifi A creció mejor con extractos de P. ostreatus que con los de P. eryngii. La cepa de Bifi B creció solo con extracto de P. eryngii, mientras que P. ostreatus no fue capaz de estimular su crecimiento. La cepa de Bifi C fue ligeramente inhibida con una mayor concentración de extractos. Las cepas de Enterococcus crecieron más lentamente que las cepas de Lactobacillus con todos los extractos probados; también la producción de AGCC fue menor. La fisiología de las cepas de Enterococcus concuerda con estos resultados. La tasa de crecimiento de las cepas de Enterococcus (Ent A y B) se estimuló mejor con extractos alcalinos.

Sin embargo, los extractos de agua estimularon la concentración de biomasa a valores más altos que los extractos alcalinos. Todos los extractos tuvieron un efecto positivo en ambas cepas.

La producción de AGCC es una característica importante de las cepas probióticas (Jus’kiewicz et al., 2007). La producción de ácido se determinó como la diferencia entre el pH de control medio fermentado (MRS con agua) y la muestra (MRS con extracto). Naturalmente, las cepas de Lactobacillus muestran la mayor producción de AGCC incluyendo ácido láctico como producto principal del metabolismo de carbohidratos. En este estudio la mayor producción de AGCC se registró para las cepas La B y Lac C, mientras que la cepa Bifi B produjo la menor cantidad de AGCC. Además, en el caso de esta última cepa la producción de AGCC disminuyó con el aumento de concentración del extracto (datos no mostrados). Las otras cepas produjeron una cantidad comparable a AGCC.

 4. Conclusiones

Los cuerpos fructíferos de P. ostreatus y P. eryngii contienen β-1,3-1,6-glucano ramificado y α-1,3-glucano lineal como los principales componentes de las paredes celulares. La posterior extracción acuosa y alcalina condujo a la evidente separación de estos polisacáridos: ambas fracciones L1 y S consisten principalmente en β-1 ,3-1 ,6-glucanos, mientras que L2 contenía un α-1,3-glucano como mayor componente polisacárido. Las fracciones L1 y L2 (extractos) se purificaron con reactivo fenólico. Como resultado, un complejo de proteína-β-1,3-1,6-glucano (L1a) y α-1,3-glucano (L2b) se separaron del β-1,3-1,6-glucano puro (respectivamente L1b y L2b). Otros polisacáridos (α-1,4-glucanos, quitina y galactomananos) están presentes en pequeñas cantidades en algunos casos; la quitina solo como un componente menor de complejos de quitina-glucano en S.

La utilización de los probióticos de los extractos L1 y L2 de P. ostreatus y P. eryngii de manera diferente constatan una estructura química de los polisacáridos diferente. Los resultados obtenidos apoyan la conclusión de que pueden utilizarse al menos dos tipos de glucanos y complejos proteoglucanos de Pleurotus para la construcción de carácter simbiótico con cepas probióticas selccionadas. Tal construcción simbiótica puede tener éxito con las cepas de Lactobacillus seleccionadas para ambos tipos de extractos. Las cepas de Bifidobacterium pueden combinarse especialmente con extractos de P. eryngii. Todas las combinaciones de probióticos y prebióticos deben verificarse in vivo antes de la confirmación final de carácter simbiótico. Esta nueva explotación de extractos de cuerpos fructíferos extiende el conocimiento del valor de las setas P. ostreatus y P. eryngii para la salud humana.